一、CCK8实验简介

CCK8（Cell Counting Kit-8）是一种广泛应用于细胞增殖和活性检测的试剂盒，其核心成分是WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯偶氮)-3-(N,N-二乙基-N-2-磺酸钠基氨基)-5-羧基苯胺）。该试剂通过代谢法测定活细胞的数量，其原理基于细胞内线粒体中的脱氢酶将WST-8还原为橙黄色的水溶性甲臜（formazan）产物。产物的吸光度值与活细胞数量成正比，因此可以通过分光光度计测量450nm波长下的吸光度来评估细胞活力。

二、CCK8实验原理

1. WST-8的作用机制

WST-8本身无色，但在细胞内被脱氢酶还原后会形成一种橙黄色的水溶性甲臜化合物。这种转化过程仅发生在活细胞中，因此吸光度可以直接反映活细胞的数量。

2. 反应动力学

在一定时间内，细胞代谢产生的甲臜量与细胞数量呈线性关系。因此，通过监测不同时间点的吸光度变化，可以动态观察细胞增殖或抑制的情况。

3. 定量分析

实验中通常使用标准曲线校准吸光度值，从而准确计算出细胞的相对数量或活力百分比。

三、CCK8实验步骤

1. 细胞准备

- 将目标细胞接种到96孔板或其他适合的培养板中，确保每孔细胞密度适中。

- 细胞培养至适宜状态，通常需要24小时以保证贴壁稳定。

2. 药物处理（可选）

如果实验涉及药物干预，则在细胞培养过程中加入不同浓度的待测药物，设置空白对照组和阳性对照组。

3. 添加CCK8试剂

- 停止培养后，小心移除培养基，避免损伤细胞。

- 每孔加入适量的CCK8溶液（通常为10μL），轻轻摇晃混匀。

4. 孵育与显色

- 将96孔板放入恒温箱中孵育1-4小时，具体时间根据细胞类型和实验需求调整。

- 确保孵育期间避免强光直射，以免影响甲臜的稳定性。

5. 吸光度测定

- 使用多功能酶标仪在450nm波长下测定各孔的吸光度值。

- 若有必要，可参考600-650nm波长作为参比波长进行背景校正。

6. 数据分析

- 记录每个样本的吸光度值，并绘制标准曲线。

- 根据公式计算细胞活力百分比或相对数量。

四、注意事项

1. 试剂储存

CCK8试剂应避光保存于低温环境中，避免反复冻融对试剂性能的影响。

2. 细胞密度控制

过高的细胞密度可能导致假阳性结果，而过低则可能降低信号强度。建议根据实验目的优化接种密度。

3. 孵育时间控制

不同类型的细胞对CCK8的代谢速率存在差异，因此需预先验证最佳孵育时长。

4. 数据可靠性

实验重复多次以提高数据可靠性，并结合其他方法验证实验结果的一致性。

五、总结

CCK8实验以其简便快捷、灵敏度高、适用范围广等优点成为细胞生物学研究的重要工具之一。掌握其原理与操作细节有助于科研人员更高效地开展相关实验，为生命科学领域的深入探索提供有力支持。